Projektplanung und Tools

bitte schickt mir die antworten zu den fragen per mail. ich werde sie hier updaten. das hilft uns beim schreiben und organisieren des projektes.

Wichtig:

gesucht wären Substanzen, die gezielt (selektiv) die gewünschte Furin Protease hemmen

nicht die anderen Furin-Proteasen hemmen (? da sonst mglw toxisch?)

andere furin-like Proteasen dürfen nicht den Prozessierungs-Job von Furin übernehmen können (müssten wir noch mal in Literatur prüfen, ggf experimentell prüfen... siRNA ko o.Ä.)

Welche Komponenten hat das Projekt

PharmAI

Virtual screen - verschiedene small compound libraries. erst einmal die FDA zugelassenen, Naturstoffe und ganz viele. Was ist da realistisch? Anzahl compounds. Habt ihr zugang zu den strukturen - 2.5 mio eine gute zahl?

wie heißen die compound datenbanken - wie viele personal braucht ihr für wie lang, wie hoch sind die kosten?

gibt es optimierungsrunden - ihr bestimmt eine/mehrere substanzen - diese werden auf interaktions-affinität und aktivität untersucht und verglichen. kann man diese daten zurück-futtern um die algorithmen zu optimieren?

könnt ihr mir einen textbaustein zu eurer pipeline - rangehensweise schicken

Vorarbeiten - möglichst schnell zu machen

screen von Furin: mit bekannten Inhibitoren (diCoumarin) und den TMPSS2 Inhibitoren Nafamostat und Camostat (die eigentlich nur unspezifische Serin Prtease Inhibitoren sind)

2bind

MST und nanoDSF im Unterauftrag.

Ich dachte an 10.000 compounds: wieviel würde das kosten?

Gernot

Herstellung der rekombinanten Proteine für Aktivitätsassays: PC1-PC7, TMPRSS2, Furin

Furinherstellung für 2 bind

Assayetablierung - biophysikalische Parameter Kd, Ki

In vitro Verdau von ACE2

Vorarbeiten - möglichst schnell machen

-- Furin assay mit versch. inhibitoren

Ralf

Zelluläre modelsysteme für corona infektion, pseudotype assay (was auch immer das ist ;-) ) - das schreibst du im proposal selber

Protein S

human lung organoind model und small animal model: machst du das selber, oder sollen wir noch jemanden reinholen ins boot...?

Vorarbeiten - möglichst schnell

zellsystem das furin exprimiert, ACE2 zellen, ...

Tools

PharmAI hat

etabliete und bessere platform zum screenen - bitte relevante publikationen schicken; oder textbaustein.

Ralf hat

-- Expressonsplasmid codon optimiert zur transienten Überexpression von Furin (verwenden wir routinemäßig, wenn wir transient HIV Envs produzieren)

-- Furin Expressionsplasmid(e) zur Generierung und Selektion stabiler Zelllinien

-- Stabile HEK293 Zellen die Furin überexprimieren. => Kann man zu Reporterlinie ausbauen e.g. Reporter mit engineerter furin cleavage site, der im Zustand "Furin nicht inhibiert" Reporteraktivität verliert oder gewinnt. Da finden wir was Nettes, um einen zellulären Assay aufzubauen. Könnten wir uns drum kümmern.

Für dich interessant? Falls ja, dann suchen wir Zelllinien und Plasmide für Dich raus. Bitte kurzer Zuruf an mich / David, bevor du die Reagenzien holen kommst

--Was wir auch passend zum Projekt im Haus haben: Vero E2 ((hohe Ace2 levels, besonders suszeptibel)

Ralf macht

-- Vero E2, die TMPRSS2 überexprimieren. Könnte man upgraden mit "Furin" Überexpression. Könnten ggf auch wir übernehmen

-- Was wir gerade herstellen: infektiöse Cov2 (und SARS-Cov1) Pseudoviren

Gernot macht

-- Furin von NEB und alle tools um den Furin assay zu machen

-- die Inhibitoren Camostat und Nafamostat